本期话题：

企业能不能将不同项目的细胞库存储在同一个液相液氮罐中?

• 这操作是否可行，法规/指南是否有明确要求/建议存储在气相中呢？

• 如果这操作可行，风险又应该如何控制？

带着以上疑问，我们一起来了解液氮罐的类型和储存方式吧！

首先，我们先来了解液氮罐是什么以及它的类型有哪些。

1. 液氮罐的3种类型

液氮罐又叫液氮生物容器，是一种生物储存容器，通常用来保存活性生物材料，其适用非常广泛。根据液氮罐的储存模式，常见的类型有液相液氮罐、气相液氮罐以及气相液氮罐（隔氮）三大类。

① 液相液氮罐：所有细胞储存于液氮液面以下，里面的温度是一致性，易造成交叉污染。其特点是：

• 液相存储

• 温度一致

• 有交叉污染的风险

图1 来自于网络视频-液相液氮罐

② 气相液氮罐：液氮在罐体外壁，里面是气相，细胞储存在气相里。虽然这种存储不易造成交叉污染，但是气相中的温度不稳定。是目前国际样本库的主流应用。其特点是：

• 气相存储

• 无交叉污染风险

• 温度不稳定

图2 来自于网络视频-气相液氮罐

③ 气相液氮罐（隔氮）：新型气相液氮罐，细胞储存在气相里，完全隔氮储存。温度更加稳定，也无交叉污染，储存空间也更大。其特点是：

• 隔氮储存

• 温度稳定

• 无交叉污染风险

• 储存空间更大

图3 来自于网络视频-气相液氮罐（隔氮）

2. 液氮罐的储存方式

接下来，我们来看看相关的国外国内法规对液氮罐的储存方式有什么要求。

• EU GMP Annex 2 - 2018[1]

  43. Seed lots and cell banks should be stored and used in such a way as to minimize the risks of contamination, (e.g. stored in the vapour phase of liquid nitrogen in sealed containers) or alteration. Control measures for the storage of different seeds and/or cells in the same area or equipment should prevent mix-up and take account the infectious nature of the materials to prevent cross contamination.

  EU GMP 附录2-2018

  43. 种子批以及细胞库适当保存和使用,以使污染(例如,存储在在密封容器内的可气化的液氮中)与变化的风险最小化。对于不同的种子，和/或，细胞在相同的区域中或相同设备中储存，则应当防止混淆，并考虑物料的感染性质，以防止交叉污染。

• NMPA GMP 附录：生物制品-2020[2]

  第四十二条 不同种子批或细胞库的贮存方式应当能够防止差错、混淆或交叉污染。生产用种子批、细胞库应当在规定的贮存条件下在不同地点分别保存，避免丢失。

• NMPA 抗体类药物现场检查指南-征求意见稿-2022[3]

  四．物料系统  chapter 1.6

  （6）细胞库应当在适当的温度下保存，如采用液氮罐或箱储存，宜在气相储存；冻存管上应有明确的标签，至少标记细胞名称、管号、批号、制备日期等内容。不同细胞库储存应当能够防止混淆、差错及交叉污染。

结论一

由此可见，对于细胞库的存储，EU/CN官方更偏于风险更低的气相液氮罐。

• 《实用器官移植电子杂志》2017年11月第5卷第6期[4]，其中对美国在液氮罐方面的要求也有相关的讲述：

  运输罐为了满足运输的条件，专门做了防震设计，除了可静置储存外，还可在充装液氮状态下运输使用，长途运输样本的液氮罐一般选用可以航空运输的干式运输罐。

  2.1 液氮液相储存（-196℃）：液态氮能使样本维持在-196℃的低温，是目前技术条件下能达到的最佳样本库保存温度。液氮容易内可装满液氮，储存更多样本，但对盛装样本的冻存管等耗材也有严格要求。与液氮气相储存相比，液态氮更易实施，但由于液态氮能渗透到冻存管内，采用液相液氮罐储存样本时，在使用前必须对冻存管进行严格的测试。

  2.2 液氮气相储存（-180℃）：一般来说液氮的气相储存优于液相储存，因为气相能够将温度维持在玻璃化温度以下（-136℃），又避免了液相储存中固有的安全问题，1995年英国血库曾发生过轰动一时的液氮冻存中破裂的血袋之间乙型肝炎病毒交叉污染事件。液氮气相是更受广泛认可的方法。美国国家癌症协会、美国血库协会、样本库协会等机构的样本库操作规范文件中均推荐使用液氮气相长期储存组织样本。

• WHO Laboratory Biosafety Manual-2020[5]

  3.4.2 Storing specimens

  Specimens must be stored in containers that are:

  - made of adequate strength, integrity and volume to contain the specimen,

  - leak-proof when the cap or stopper is correctly applied,

  - made of plastic (whenever possible),

  - free of any biological material on the outside of the packaging,

  - correctly labelled, marked and recorded to facilitate identification, and

  - made of an appropriate material for the type of storage required.

  Care must be taken when storing specimens in liquid/vapour phase nitrogen. Only tubes specifically noted by the manufacturer as being suitable for liquid nitrogen cryogenic storage should be used to reduce the likelihood of breakage on removal from liquid nitrogen. It is important to note that liquid and vapour can enter improperly sealed or cracked tubes and can rapidly expand on removal of the tube from storage; this can lead to breakage and/or explosion. Thermal protective gloves and apron should be worn when accessing liquid nitrogen storage and a visor should be worn for splash protection.

  WHO 实验室安全手册-2020

  3.4.2 储存样本

  样品必须储存在以下容器中：

  - 足够的容量、完整和空间

  - 防泄漏的盖子或塞子

  - 由塑料制成（尽可能）

  - 包装外部不含任何生物材料

  - 正确标记、标识和记录，以便于识别

  - 对于不同种类的储存需要的容器应由适合的材料制成

  在液/气相氮中储存样本时必须小心。只有生产商特别指明适合液氮低温储存的试管才能使用，以减少从液氮中取出时试管破裂的可能性。必须注意的是，液体和蒸汽可能会进入密封不当或破裂的试管，并在从仓库中取出时会迅速膨胀，这可能导致破损和/或爆炸。在进入液氮储藏室时应戴上热防护手套和围裙，并佩戴防护罩以防飞溅。

结论二

气相液氮在行业内被广泛认可，其中EU/CN法规指南已有相关描述。因此，若使用液氮液相，容器需有更多的要求及需对其进行更严格的测试。

因此，各个官方是比较推荐使用气相液氮罐来储存细胞库，以此来减少污染风险。若使用液氮液相罐的话，则需要对比相对应的法规要求以及更严格测试。

参考资料

[1] EU GMP Annex 2

[2] GMP 附录：生物制品

[3] 抗体类药物现场检查指南-征求意见稿

[4]《实用器官移植电子杂志》2017年11月第5卷第6期

[5] WHO Laboratory Biosafety Manual